Neue Publikation: Standardisiertes Protokoll zur Analyse cap-unabhängiger Translation in Weizenkeimextrakt veröffentlicht
Wir freuen uns, die Veröffentlichung unseres neuen Methodenartikels "A luciferase-based assay for assessing cap-independent translation in Wheat Germ Extract" bekanntzugeben. Das Protokoll ist im Open-Access-Journal Bio-protocol erschienen und beschreibt einen standardisierten Workflow zur Untersuchung der cap-unabhängigen Translation mithilfe eines zellfreien Weizenkeimextrakt-Systems.
Warum ist cap-unabhängige Translation wichtig?
Die Proteinbiosynthese eukaryotischer Zellen erfolgt normalerweise über eine sogenannte 5'-Cap-Struktur der mRNA. Unter bestimmten Bedingungen – beispielsweise während einer Virusinfektion oder unter zellulärem Stress – können jedoch alternative Mechanismen die Translation initiieren. Eine zentrale Rolle spielen dabei Internal Ribosome Entry Sites (IRES), RNA-Sequenzen, die eine cap-unabhängige Translation ermöglichen. Diese Mechanismen gewinnen auch für biotechnologische Anwendungen zunehmend an Bedeutung, insbesondere für die Entwicklung zirkulärer RNAs (circRNAs), die aufgrund ihrer Struktur nicht über den klassischen cap-abhängigen Mechanismus translatiert werden können.
Ein reproduzierbarer Workflow für die Forschung
Das veröffentlichte Protokoll beschreibt einen vollständigen experimentellen Arbeitsablauf – von der Herstellung geeigneter DNA-Templates über die in vitro-Transkription und Qualitätskontrolle der RNA bis hin zur zellfreien Translation im Wheat Germ Extract und der quantitativen Messung der Proteinproduktion mittels Firefly-Luciferase. Besonderes Augenmerk wurde auf reproduzierbare Qualitätskontrollen gelegt, sodass das Verfahren von anderen Arbeitsgruppen leicht übernommen werden kann.
Der beschriebene Workflow eignet sich unter anderem für:
den Vergleich verschiedener IRES-Sequenzen,
die Untersuchung cap-unabhängiger Translation,
die Charakterisierung von RNA-Modifikationen zur Verbesserung der Translationseffizienz,
sowie die Entwicklung und Optimierung neuer RNA-basierter Technologien.
Bedeutung für das Projekt ciRcNApp
Die Publikation stellt einen wichtigen methodischen Baustein unseres BMFTR-geförderten Projekts ciRcNApp dar. Ziel des Projekts ist es, zirkuläre RNAs als neuartige Wirkstoffklasse für den RNA-basierten Pflanzenschutz zu etablieren. Da zirkuläre RNAs keine 5'-Cap-Struktur besitzen, ist die effiziente cap-unabhängige Translation eine zentrale Voraussetzung für ihre Anwendung. Das veröffentlichte Protokoll schafft hierfür eine standardisierte Grundlage, um unterschiedliche IRES-Elemente und weitere RNA-Designs systematisch miteinander vergleichen zu können. Diese methodische Basis wird in den kommenden Projektphasen für die Entwicklung und Optimierung funktioneller zirkulärer RNAs genutzt.
Wir freuen uns, mit dieser Veröffentlichung einen Beitrag zu reproduzierbaren Methoden in der RNA-Forschung leisten zu können und hoffen, dass das Protokoll Forschenden weltweit als praktische Ressource dient.